Hópur Long Li við Lífvísindadeild háskólans í Peking gaf út grein sem ber titilinn "Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the TOM-TIM23 supercomplex", birt í Nature Structural & Molecular Biology. Rannsóknin greinir frá byggingar- og lífefnafræðilegum niðurstöðum TOM-TIM23 ofursamstæðunnar sem miðlar próteinflutningi í hvatberum, sýnir nýja leið fyrir próteininnflutning í gegnum TOM flókið yfir ytri himnu hvatbera og endurskilgreinir kjarnasamsetningu TIM23 flutningsfléttunnar í innri. hvatbera himna.
Sem ein mikilvægasta frumulíffæri heilkjörnungafrumna gegna hvatberar mikilvægu hlutverki í orkuöflun, innanfrumuefnaskiptum, samvægi og frumudauða. Hvatberar hafa einstaka innri og ytri tvílags lípíðhimnubyggingu, með meira en 1,000 próteinum dreift inni. 99% hvatberapróteina eru kóðuð af umfrymisgenum, mynduð í ríbósómum í umfryminu og flutt yfir himnuna til hvatberanna til að sinna hlutverki sínu. Þess vegna er flutningur hvatberapróteina mikilvægur til að viðhalda og stjórna hvatberavirkni og stökkbreytingar í skyldum genum eru nátengdar þróun margra efnaskiptasjúkdóma og krabbameina í mönnum. Hópur Li Long hefur unnið að því að kanna sameindakerfin sem hvatberaprótein komast inn í hvatbera og útgefin vinna felur í sér að leysa leiðina sem hvatberahimnuprótein fara inn í innri himnuna í gegnum TIM22 flutningsfléttuna (Zhang Y. o.fl. Cell Research 2021). Hlutverk TOM-TIM23 ofursamstæðunnar í hvatberapróteinflutningi er enn mikilvægara í þessari rannsókn. Þessi ofursamstæða, sett saman úr tugum próteinundireininga, spannar innri og ytri tvílaga himnur hvatbera og stjórnar flutningi meira en 500 leysanlegra hvatbera og himnupróteina. Undanfarin 40 ár hafa vísindamenn rannsakað einstakar undireiningar TOM og TIM23 flutningsfléttunnar ítarlega og ítarlega. Hins vegar, vegna mjög kraftmikils eðlis þessarar ofursamstæðu, er skilningur á meginspurningunni um hvernig þessar undireiningar setjast saman til að mynda próteinflutningsleiðina enn mjög takmarkaður, sérstaklega fyrir TIM23 flókið í innkirtlahimnu, þar sem samsetning kjarnans. flutningadeild hefur verið mjög óljós.
Í þessari rannsókn byrjuðu höfundarnir fyrst á samsetningu stöðugs TOM-TIM23 ofursamstæðu, könnuðu ýmis samsetningarkerfi og völdu að lokum að sameina grænt flúrljómandi prótein við hvatberaprótein sem flutnings hvarfefni, og fanga millistig TOM-TIM23 supercomplex til að flytja prótein hvarfefni í gerfrumum. Eftir in vitro hreinsun gæti þetta millistig enn verið stöðugt fyrir frekari burðarlíffræði og lífefnafræðirannsóknir. Með einkornagreiningu á þessu milliástandi með kryo-rafeindasmásjá, komust höfundarnir að því að það er bein víxlverkun á milli TOM-komplexsins sem staðsett er í ytri himnunni og TIM23-samstæðunnar sem staðsett er í innri himnunni, sem tengir innri og ytri hvatberahimnur. , sem skilar próteinhvarfefninu á skilvirkan hátt frá ytri hvatberahimnu til innri himnunnar (mynd 1a). Sérstaklega var TOM flókið leyst upp í 4,1 Å upplausn. Uppbyggingin leiddi í ljós "skautaða amínósýruferil" innan innri veggs Tom40 rásar undireiningarinnar, sem er varðveitt yfir tegundir og miðlar leið próteins hvarfefnis í gegnum Tom40 milliholu í óbrotnu formi (mynd 1b). Þessi leið er frábrugðin tveimur yfirhimnuferlunum í Tom40 sem áður var lagt upp með á grundvelli lífefnafræðilegra tilrauna, sem sýnir fram á fjölhæfni TOM flóksins við að þekkja og flytja ýmis hvatberaprótein á skilvirkan hátt.
Mynd 1. Uppbygging TOM-TIM23 ofursamstæðunnar. (a) Skýringarmyndasamsetning og uppbygging kryó-rafeindasmásjár TOM-TIM23 ofursamstæðunnar. (b) Krý-rafeindasmásjárbyggingarlíkan af TOM flókinu sem inniheldur prótein hvarfefnið. (c) AlphaFold2 burðarlíkan af Tim17-Tim23-Mgr2 hetrótrímerinu
Að auki kynntu höfundarnir kerfisbundið óeðlilegar amínósýrur á mismunandi stöðum próteinhvarfefnisins og könnuðu umhverfi próteinhvarfefnisins í flutningsleið TOM-TIM23 með því að nota ljóskrosstengingu og auðkenndu þannig kjarnaundireininguna sem beinlínis hjálpar hvarfefninu að fara yfir tvær lípíðhimnur. Tilraunaniðurstöðurnar sýndu að C-endabút próteinhvarfefnisins getur krosstengst við Tom40 undireiningu ytri himnunnar, niðurstaða sem er í samræmi við byggingarathuganir. Það kemur hins vegar á óvart að N-endabút próteinhvarflagsins þvertengingar við bæði Tim17 og Mgr2 undireiningar í innri himnunni, en ekki við Tim23 undireininguna, sem almennt er skilgreind sem flutningsrás innri himnunnar. Þessi niðurstaða bendir til þess að það gæti verið veruleg skekkja í skynjun á kjarnaflutningsleið TIM23 flókins í fyrri rannsóknum. Til að bera kennsl á kjarnaflutninga undireiningar og ferla í TIM23, notuðu höfundarnir blöndu af AlphaFold2 líkangerð, lífefnafræðilegri krosstengingu, gererfðafræði og in vitro flutningi hvatbera próteina, og komust að því að kjarnahluti TIM23 flókins er hetrótrímer sem samanstendur af Tim23, Tim17 og Mgr2 undireiningum, þar sem Tim17 og Mgr2 augliti til auglitis mynda ráslíka byggingu, en Tim23 binst Tim17 í bak-til-baki formi og tekur ekki þátt í rásarmyndun (Mynd 1c) ). Við próteinflutning fer próteinhvarfefnið í gegnum ráslíka uppbyggingu sem myndast af Tim17 og Mgr2 og snertir ekki Tim23 undireininguna beint. Stökkbreytingartilraunir leiddu í ljós að niðurfelling Mgr2 í geri hafði ekki áhrif á próteinflutning, sem bendir til þess að aðeins sé þörf á Tim17 í ráslíkri uppbyggingu sem myndast af Tim17 og Mgr2. Ástæðan fyrir því að Tim17 getur hjálpað próteinum að komast yfir innhimnu er vegna þess einstaka þess. yfirborðs amínósýrudreifing: annars vegar hefur Tim17 mjög varðveitt neikvætt hlaðið svæði við inngang innhimnunnar sem getur truflað staðbundið. Annars vegar er Tim17 með mjög varðveitt neikvætt hlaðið svæði við inngang innri himnunnar , sem getur truflað staðbundna fosfólípíð tvílaga uppbyggingu og lækkað orkuþröskuld fyrir prótein til að fara yfir lípíðhimnuna; á hinn bóginn hefur Tim17 varðveitt vatnsfælnt svæði í miðju brautarinnar, sem hjálpar til við að halda innri himnu hvatberans í loftþéttu ástandi og viðhalda himnunni sem nauðsynleg er fyrir lífeðlisfræðilega starfsemi hvatbera. Með því að taka saman niðurstöður ýmissa byggingar- og lífefnafræðilegra tilrauna má draga þá ályktun að TIM23 flókið, með Tim17 undireininguna í kjarna sínum, taki upp blandaðan hátt til að hjálpa til við próteinflutning, þ.e. rás til að hjálpa próteinum yfir himnuna, eða Tim17 virkar í vinnuham fyrir innsetningarensím til að framkvæma próteinflutning einn án þess að þurfa að mynda rás. Þessi niðurstaða leiðréttir ranghugmyndina á þessu sviði undanfarin 40 ár að Tim23 undireiningin sé kjarnarás.
Í stuttu máli, þessi rannsókn þróaði nýja stefnu fyrir próteinflutningsrannsóknir, leiddi í ljós mikilvæga leið fyrir hvatberaprótein til að fara yfir tvílags lípíðhimnu um TOM-TIM23 ofursamstæðuna (Mynd 2), kollvarpaði langvarandi þekkingu á sviði kjarnaþátta í innri himnu TIM23 flutningsfléttuna, og uppgötvaði alveg nýjan hátt á próteinflutningsensímvirkni, sem leggur traustan grunn fyrir alhliða og djúpstæðan skilning á nýmyndun hvatbera. nýmyndun, sem leggur traustan grunn að alhliða og ítarlegum skilningi á lífmyndun hvatbera.
Mynd 2. TOM-TIM23 flutningsleið hvatbera
Long Li er samsvarandi höfundur greinarinnar og Xueyin Zhou, doktorsnemi frá Peking University-Tsinghua Joint Center for Life Sciences bekknum 2018, Yuqi Yang, doktorsnemi frá School of Life Sciences bekknum 2019, Dr. Peng Wang frá Peking-háskólanum fyrir kryó-rafeindasmásjárskoðun og Shanshan Wang, doktorsnemi frá Lífvísindasviði 2020, eru fyrstu höfundarnir. Dongjie Sun, fyrrverandi tæknimaður í rannsóknarstofu Li Long, Xiaomin Ou, doktorsnemi í Lífvísindaháskólanum, árgangi 2022, og Yuke Lian, doktorsnemi í Lífvísindaháskólanum, árgangi 2021, lögðu mikið af mörkum til þessar rannsóknir. Prófessor Ning Gao og aðstoðarrannsakandi Ningning Li frá Lífvísindasviði Peking háskólans og vísindamaðurinn Xinzheng Zhang frá Institute of Biophysics, Kínverska vísindaakademíunni, veittu mikla hjálp við útreikninga á gögnum um kryo-rafeindasmásjá, og prófessor Qing Li og prófessor. Gain Chang frá Lífvísindasviði, Peking University, veitti mikilvægar leiðbeiningar um gererfðafræði og ljóskrosstengingartilraunir. Rannsóknarvinnan var studd af kryo-rafeindasmásjárvettvangi Peking háskólans, High Performance Computing Center, Instrumentation Center of School of Life Sciences og National Phoenix Protein Platform og var styrkt af State Key Laboratory of Membrane Biology, Peking University-Tsinghua Joint Center. fyrir lífvísindi og National Natural Science Foundation of China.
